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培养箱中微生物菌种保藏方法
来源:技术文章    发布时间:2022-06-24    浏览:660次
常用的冷冻保存法包括:
①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃):低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便,也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多,有些可添加保护剂。此外,也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器内,再放入低温冰箱内进行保存的。
②干冰保存法(-70℃左右):即将菌种管插入干冰内,再置于冰箱内进行冷冻保存。
③液氮保存法(-196℃):是适用范围*的微生物保存法。其操作步骤如下,a、装安瓶管:使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂(保存霉菌不用防冻剂)的灭菌溶液中,将0.2~1ml的这种溶液分装于安瓶中,或在装有分散剂的安瓶中直接接种,或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。
b、熔封安瓶管:若直接贮存于气相液氮中(-150℃~-170℃)时,则不需熔封。
c、检查安瓶管是否熔封良好:即在4℃下,将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡2~30分钟后,观察有无色素进入安瓶。
d、缓慢冷却:将熔封安瓶管置于小罐中,然后用液氮气以约1℃/min的速度冷却至-25℃左右,也可在-20℃~-25℃的冰箱内缓慢冷却30~60min。
e、速冷:最后浸入液氮中快速冷却至-196℃。
7、冷冻干燥保存法:其原理是首先将微生物冷冻,然后在减压下利用升华现象除去水分。事实上,从菌体中除去大部分水分后,细胞的生理活动就会停止,因此可以达到长期维持生命状态的目的。该方法适用于绝大多数微生物菌种(包括噬菌体和立克次氏体等)的保存。
在进行冷冻干燥时,需注意以下几个问题:
a、冷冻干燥前的培养条件:首先检验菌种纯度。一般地说,将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜;菌龄以达到对数生长期为好;若为有芽孢或孢子的微生物,则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好;菌液浓度以高为好,如细菌应达到109~1010/ml。
b、菌株号码等的标记:可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签。
c、安瓶的准备:将安瓶在2%HCl中浸泡过夜,自来水冲洗3次后,蒸馏水刷净,干燥,塞棉塞,贴标签,干热灭菌或温热灭菌后,60℃恒温干燥。
d、添加保护剂:常用的保护剂有脱脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加7.5%葡萄糖的血清等等。
8、Bordelli氏法:取干净的小试管(8×60mm)塞上棉塞,灭菌。用灭菌的脱脂牛乳洗脱试管斜面上的菌苔,制成浓厚菌悬液。然后用无菌吸管将菌悬液滴入小试管底部。每管一滴,然后转动小试管使菌液分散在试管底部的壁上。标记菌名。将小试管装在15×150mm的试管中,在大试管底部事先装上1.5cm高的(P2O5或KOH),管口用带玻璃管的橡皮塞塞紧,蜡封。将大试管与真空泵连通,抽真空至0.1~0.2mm汞柱时,将玻璃管熔封,置室温暗处或冰箱保存。
仪器与材料1、斜面菌种:丝状真菌、酵母菌、芽孢杆菌和无芽孢杆菌各一支。
2、接种用具一套。
3、灭菌物品:1ml、5ml吸管,长滴管,安瓶管,9ml无菌水试管,砂土管,液体石蜡,脱脂牛乳。其中,液体石蜡的处理为1.5kg/cm2压力灭菌1小时或1kg/cm2压力灭菌3次,每次30分钟。接着检查是否*无菌,即接入肉汤中检查有无杂菌生长。最后放在60~80℃轰烤以去除水分。脱脂牛乳的处理为2000rpm离心10分钟脱脂,然后0.5kg/cm2压力灭菌20分钟,或间歇灭菌3次,经检查无菌后备用。
4、P2O5,无水CaCl2各一瓶。
5、真空干燥器,真空泵。
方法1、液体石蜡覆盖法:取待保存的菌种斜面,用5ml无菌吸管向内加入灭菌石蜡,要求液体石蜡高出菌斜面1cm左右,若不够此高度,则常会引起斜面抽干现象。
2、砂土管法:用1ml无菌吸管吸取0.2~0.5ml菌悬液,滴入砂土管中,充分混匀后,将砂土管放入真空干燥器内,抽干,真空干燥器内需放置无水CaCl2。最后,将干燥好的砂土管取出,迅速于火焰上蜡封管口,并在室温下或冰箱中进行保存。
3、冷冻干燥保藏法:
①用灭菌长滴管取出2滴(约0.1ml)无菌脱脂牛乳,置于无菌安瓶管中,然后用另一支无菌滴管取出等体积的浓菌液,同样置于此安瓶管中,充分混匀。
②集中安瓶管,置于100ml烧杯中,将烧杯装进真空冷冻干燥器的钟罩内,开机并开冷却水后,使菌液在-20℃温度下迅速冻结成固体,然后抽真空使水分升华,2小时后,可以停止冷冻并在稍高的温度下进行干燥,直至全干为止。
③最后取出安瓶管,并将其与真空泵连接,再抽真空后,迅速将安瓶管熔封,最后冰箱保存。
4、甘油管保藏法:在5ml菌种保藏管中,将等体积的菌悬液和40%的甘油充分混匀后,于-20℃冰箱中保存。


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